彗星实验（Comet assay）也被称为单细胞凝胶电泳实验（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的技术。当各种内源性和外源性 DNA 损伤因子诱发细胞 DNA 链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA 以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。电泳过程中，如果DNA没有损伤，则将停留在原位，染色后呈圆形的荧光团，无拖尾出现。如果DNA受损，断裂的碎片进入到凝胶中，在电场的作用下，DNA碎片离开原位向阳极迁移，形成拖尾。DNA受损越严重，断裂越多，产生的碎片就越多、越小，则向阳极迁移的DNA碎片量就越多，迁移距离也越长，荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。

 

 

目前有两种常见的彗星实验检测方式——碱性处理&中性处理。在碱性处理条件下，DNA发生变性，因而可检测包括单链及双链断裂在内的所有DNA 损伤；在中性处理条件下，DNA 维持双链构象，因而仅可以检测双链断裂。

 

实验大体流程如下：

 

1. 制备单细胞悬浮液，在 37℃ 条件下，悬浮液与低熔点琼脂糖（LM琼脂糖）混合；
2. 将琼脂糖、细胞混合物涂布在预处理的载玻片上；
3. 4℃条件下用裂解液处理30-60min或过夜，裂解液由去垢剂及高盐溶液组成，可去除多余的细胞膜及组蛋白；
4. 将载玻片浸入电泳溶液中；
5. 进行凝胶电泳，随后，中和载玻片，待LM琼脂糖完全干燥后，用荧光染料染色，并于荧光显微镜下观察DNA损伤程度。

 

注：最常用的荧光染料是SYBR Gold，但荧光染料的观察需要荧光显微镜。如果选择银染，使用标准的光学显微镜观察即可。

 

图片处理

 

在拍照时以tif格式保存图片，然后用CASP彗星分析软件分析，如下图是软件打开的界面➙

 

 

接下来➙导入图片，用白色画框选中要分析的区域。下图中的“调整”项可以调整画框的位置以包含整个细胞，开始分析前要点击“开始”，然后点“分析”，再点“保存”，这样一张图的数据就分析完了，数据会保存在系统里。点击“翻页”可以继续分析下一张图。

 

 

分析完所有图片后导出数据到Excel表格，保留TailDNA%（尾部DNA百分含量），TailLength（尾长），TailMoment（尾矩）三列数据。根据细胞尾部的DNA百分含量（即TailDNA%），将采集的细胞图像分为5级：彗星尾部荧光强度（TailDNA%）占总强度为0-6%是0级；6.1%-17.0%是1级；17.1%-35.0%是2级；35.1%-60.0%是3级；60.1%-100.0%是4级。

 

 

彗星率等于彗星细胞数目（除去0级细胞）占总细胞数目的百分比。任意值等于各等级细胞的百分比与其对应的级别号的乘积之和，它可以综合反映细胞的DNA损伤情况。最后，综合分析Tail DNA%、Tail length、Tail moment、彗星率和任意值，共5个指标比较细胞的DNA损伤程度。

 

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CometAssay®彗星分析专用玻片

 

 

 

CometAssay® 彗星分析银染试剂盒

 

 

CometAssay®彗星分析试剂盒

 

 

CometAssay®彗星电泳检测系统

 

 

 

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除了以上试剂盒外，Trevigen还可单独提供彗星实验的各种试剂组分，例如：低熔点琼脂糖CometAssay® LMAgarose）、细胞裂解液（CometAssay® Lysis Solution）。

 

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