一、抗体染色方法

直接染色

直接免疫荧光染色时，细胞与直接偶联有荧光染料（如 FITC 标记）的抗体孵育。这种方法的优点在于只需要一步抗体孵育，从而排除了二 抗非特异性结合的可能性。这对细胞内染色特别有用，因为包含二抗的大抗体荧光复合物有可能被困住，造成非特异性结合甚或无法进入细 胞，而使一抗检测不到。

间接染色

间接染色时，一抗是没有标记荧光色素，而是通过带有荧光色素标记的二抗进行检测。这种二抗是对一抗具有特异性的抗体。另外可选择使 用亲和素-生物素系统，即使用偶联了生物素的抗体，通过带有荧光标记的亲和素进行检测。随着目前有更多种类的偶联二抗可以选择，这种 方法意味着结合使用一种带有荧光标记的二抗，可配合针对不同目标蛋白而没有连接偶联物的一抗，来进行流式细胞术的分析。这拓宽了研 究者对目标蛋白的选择。

细胞内染色

使用流式细胞技术进行的细胞内源抗原的染色检测成功与否，取决于各种不同的固定和通透方法，以使抗体接近细胞内部蛋白。任何情况下， 要获得成功的染色都必须对实验条件进行优化，包括测定抗体效价，采用合适的对照来正确设定流式细胞仪，并且优化固定和通透步骤。

检测分泌蛋白

检测分泌蛋白是相对困难，是由于蛋白在检测前就从细胞中向外分泌或者迅速降解。进行此类实验需要使用高尔基体阻断剂(Golgi-Block)， 例如布雷非德菌素 A (Brefaldin A)。细胞与 Brefaldin A 孵育，可以阻止蛋白从高尔基体中释放。任何已表达而停留在高尔基体内的蛋白，都 可以在细胞内被检测，使用细胞内染色方法，便可检测此类目标蛋白。

二、选择合适的荧光色素偶联物

对一个给定的抗体，能否从阴性信号中分辨出阳性信号，往往取决于所用的荧光色素偶联物。各种荧光色素相对强度的一般准则是，从最亮到最暗：PE、PE-Cy7、PE-Cy5、APC > APC- Cy7、Alexa Fluor 647、AlexaFluor 700 > FITC、Pacific Blue、Alexa Fluor 488。这是一般模式。在个别抗体中，这相对强度的模式会有差异。一个有高表达水平的抗原，几乎使用任何一种荧光色素都能检测出其抗原和从阴性信号中分辨出来。水平较低的抗原或需要配合使用较亮的 PE 或 APC 这类偶联物来获取高信背比，以便从未染色细胞中充分地分离出阳性细胞。荧光色素的相对强度取决于仪器。这是由于不同的仪器上的激光和滤光片的组合存在差异。切记使用合适的流式细胞仪。